配合飼料中飼用酶的加工穩(wěn)定及檢測方法

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目前世界上許多國家，常向單胃動物的飼料中添加酶。這顯然是由于酶對單胃動物的生產(chǎn)性能有確定的改善作用，但要證實在商品飼料中有酶存在并非易事，對此，至今已進行了許多研究。酶是蛋白質，它與所有其他的飼料蛋白質一樣，對飼料加工處理非常敏感。但飼料蛋白質是以氨基酸為單位而發(fā)揮作用的，所以無需維持構型，而飼料酶在飼料加工過程中要么發(fā)生不可逆的變性，要么不再發(fā)揮作用。因此，有必要檢測配合飼料中酶的活性。本文的重點不是討論現(xiàn)有的酶活的測定方法，而是闡述飼料中所用酶的特性，包括不同來源酶對體外熱穩(wěn)定性之間的差異、因酶與飼料基質的互作而給分析帶來的難題（及消除這種效應的方法）、飼料加工試驗的有關數(shù)據(jù)以及未來的發(fā)展趨勢。

　　大多數(shù)豬禽配合飼料均需要進行一定程度的加工處理。有些飼料需要制成顆粒，其加工過程是先通過蒸汽，對飼料混合物進行調(diào)質，然后經(jīng)壓摸擠壓成顆粒。制?？梢蕴岣唢暳系臓I養(yǎng)濃度，改善飼料的儲藏特性，并減少飼料中的微生物含量。制粒溫度一般為65~90攝氏度（Gibson，1995），這樣高的溫度可以破壞對熱敏感的營養(yǎng)素（包括酶）。

　　在過去幾年中，人們對飼料源病原體以及影響制粒質量的因素的關心，促使飼料生產(chǎn)商提高飼料加工的溫度、時間和壓力，并將飼料進行二次制?；蚺蚧≒ickford，1992）。飼料加工處理程度的加強使酶的穩(wěn)定性更加重要。目前已采取幾種途徑來克服這難題，包括通過在飼料顆粒冷卻后添加液態(tài)酶以避免一起加工處理對酶活性的影響。盡管可以在制粒后加酶，但飼料酶一般還是在加工處理前添加到粉狀飼料中。通過使用疏水性包被保護層或選用耐熱性更強的酶，可以降低熱處理的對酶活的影響。

　　至今公開發(fā)表的有關飼料酶活性保存率的研究資料仍然有限（Chesson，1993）。然而，酶的穩(wěn)定性對于飼料生產(chǎn)商來說極其重要，必須保證在酶制劑銷售之前進行酶的實驗室評定。1993年以來，在報刊或會議論文集上已有多項研究成果報道。在評論性的科技文獻中也有幾項試驗結果。顯然，活體外測定酶活，無論是在溶液中還是在飼料中，都是極其重要的。最近的研究表明，體外酶活的測定值必須通過體內(nèi)效應的檢測結果來驗證。

植酸酶

　　由于植酸酶使用量約占商品酶制劑用量的20%，所以有關植酸酶熱穩(wěn)定性的研究報道相當多（Bedford和Schulze，1998）。之所以如此受到關注，可能是由于許多植物性的飼料原料中均含有植酸，由于植酸的存在使得磷和其他營養(yǎng)素難以吸收利用（Cheryan，1980；Eeckhout和dePaepe，1994；Ravindran等，1995）。然而，單胃動物體內(nèi)的內(nèi)源性植酸酶缺乏活性或活性很低（Pallauf和Rimbach，1997）。更為復雜的是，同一植酸來源的植物還含有相當數(shù)量的植酸酶，并且磷消化的營養(yǎng)性問題與因磷在土壤中的富積而引起的環(huán)境污染問題相互交織。磷污染已成為集約化畜禽產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的限制因素。

　　植酸酶的來源廣泛，其特性也各不相同。Liu等（1998）綜述了1998年之前的文獻。結果表明，來自細菌、真菌、酵母和植物的植酸酶的最適活性溫度為45~77攝氏度，其差異高達32攝氏度。Dvorakova等（1997）描述了從黑曲霉（Aspergillus niger）中分離到的植酸酶特性。該植酸酶在25~65攝氏度的溫度范圍內(nèi)具有活性，其最適溫度為55攝氏度；其在60攝氏度下培養(yǎng)10分鐘可使最初活性喪失5%，而在80攝氏度下培養(yǎng)10分鐘可使最初活性喪失80%。作為尋找耐熱性酶類的部分工作，Wyss等（1998）對從煙曲霉（A. fumigatus）和黑曲霉（A. nige）中分離到的純化植酸酶的熱變性進行了研究。這兩種來源的植酸酶在低至55攝氏度時就會發(fā)生變性。然而，在溫度提高到90攝氏度時，來自煙曲霉（A. fumigatus）的植酸酶再次折疊成一種活性構型，但來自黑曲霉（A. nige）的植酸酶不會發(fā)生這種變化。無疑，某些耐熱性的植酸酶類在不久的將來將投入商業(yè)使用。

　　溶液中的酶遇熱失活，并不表明飼料中的酶遇熱也失活，這是因為飼料中的酶與飼料基質存在互作。實際上，飼料原料在短時間內(nèi)能夠保護酶免受蒸汽或高溫的破壞（Chesson，1993）。測定顆粒飼料中的植酸酶活性為商業(yè)上評價飼料中植酸酶失活的程度提供了更準確的數(shù)據(jù)。Simons等（1990）將植酸酶添加到“通用豬飼料”中，該飼料在制粒前被加熱至50攝氏度或65攝氏度。結果表明，加熱至50攝氏度時使顆粒溫度達到78攝氏度或81攝氏度，此時并未使酶的活性降低；但加熱至65攝氏度時使顆粒溫度達到84攝氏度或87攝氏度，此時則使酶的活性喪失17%或54%。Gibson（1995）在小麥基礎日糧中添加3種植酸酶制劑，并在65~95攝氏度溫度下制成顆粒飼料。結果表明，其中2種植酸酶制劑在65攝氏度制粒溫度下就已失活了，僅剩下1種植酸酶制劑在85攝氏度以上制粒溫度下還保留相當數(shù)量的活性。除了研究酶在溶液中的穩(wěn)定性之外，Wyss等（1998）還在制粒（75攝氏度或85攝氏度）前將從煙曲霉和黑曲霉中分離到的植酸酶添加到商品飼料中。結果表明，在制粒溫度為75攝氏度時，這兩種植酸酶在顆粒飼料中的活性回收率是相似的；但在制粒溫度為85攝氏度時，來自黑曲霉的植酸酶活性比來自煙曲霉的植酸酶活性要喪失得更多，這也支持了他們有關變性動力學的研究結果。Eeckhout 等（1995）將商品植酸酶制劑添加到飼料中，結果表明，制粒溫度為69~74攝氏度時可使植酸酶活性喪失50%~65%。

　　失活不僅影響添加到飼料中的微生物酶類的作用，而且也影響到飼料原料中天然存在的酶類的作用。Gibson（1995）發(fā)現(xiàn)，在85攝氏度以上溫度下制粒將使小麥中的內(nèi)源調(diào)查性植酸酶活性大量失活。Eeckhout和dePaepe（1994）在對不同飼料中植酸酶活性的調(diào)查報告中報道，小麥麩富含植酸酶，但其制粒樣品的植酸酶活性僅為未制粒樣品的56%。Jongbloed和Kemme（1990）通過3個試驗發(fā)現(xiàn)，在接近80攝氏度下制粒可使豬飼料中的植酸酶活性降低，其中豬飼料是以富含或缺乏植酸酶活性的飼料原料為基礎配制的。他們還進一步進行了試驗，以測定制粒對磷的表觀吸收率的影響。他們在其中兩個試驗發(fā)現(xiàn)，對富含植酸酶的飼料制粒使磷的吸收率降低，該結果與內(nèi)源性植酸酶失活的結果一致。

　　研究機構與飼料工業(yè)對有關植酸酶穩(wěn)定性研究的關注，是由于目前所用的加工溫度越來越高，以及因營養(yǎng)與環(huán)境因素使得磷的吸收率越來越重要。對外源性酶類增加包膜或制成顆粒，為目前保護酶類免受熱破壞提供了一種方法。更為基本的方法可能就是耐熱性酶類的分離或者在酶變性后再次還原到活性構型。另人遺憾的是，這些方法都不能防止高溫對飼料原料中含有的內(nèi)源性酶類的破壞。

　　β-葡聚糖酶

　　由于β-葡聚糖酶制劑的商品化生產(chǎn)，使得大麥可作為飼料原料添加到家禽日糧中，并且不會因高β-葡聚糖水平而降低家禽的生產(chǎn)性能及產(chǎn)生粘性糞便（Campbell和Bedford，1992）。目前，β-葡聚糖酶已廣泛用于世界大麥產(chǎn)區(qū)。不過，有關熱處理對添加到飼料中β-葡聚糖酶影響的研究報道仍然有限。

　　Eeckhout 等（1995）對在50~95攝氏度下調(diào)質和在72~91攝氏度下制粒的商品仔豬料中的β-葡聚糖酶活性進行了測定。結果表明，即使在最低溫度下，飼料中的β-葡聚糖酶活性在加工后亦喪失40%，而在最高溫度下，僅保存7%的活性，并且2/3的活性是在調(diào)質期間喪失的。另一方面，Esteve-Garcia等（1997）發(fā)現(xiàn)，添加到肉仔雞料中的β-葡聚糖酶經(jīng)過接近80攝氏度的調(diào)質與制粒溫度仍能保留大部分的活性。其所使用的酶被制成微細顆粒。這表明，β-葡聚糖酶可以穩(wěn)定的形態(tài)添加到飼料中。

　　至少有2個試驗對肉用雛雞在飼喂經(jīng)熱處理的酶補充日糧后的生產(chǎn)性能進行了測定。McCracken等（1993）在大麥基礎日糧中添加了一種穩(wěn)定形態(tài)的商品酶混合物，其中含有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性，日糧在制粒前于85攝氏度溫度下加熱15分鐘。結果表明，日糧在未補充外源性酶的情況下進行熱處理，使飼料營養(yǎng)物質的表觀消化率降低、肉用雛雞腸道內(nèi)容物的粘度增加及糞便干物質含量減少；但在補充外源性酶的情況下進行熱處理，則提高了飼料營養(yǎng)物質的消化率，并消除了熱處理引起的不利效應。這充分說明，酶在85攝氏度溫度下仍保持活性。Vukic-Vranjes等（1994）測定了兩種日糧中添加商品酶混合物的效應，其中一種日糧含有20%的大麥。該酶混合物含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和果膠酶活性。這兩種日糧在70~75攝氏度下調(diào)質，在110~120攝氏度下制?；驍D壓膨化。與制粒相比，擠壓膨化對雛雞生產(chǎn)性能產(chǎn)生不利影響。同時，擠壓膨化還使飼料的體外粘度增加，這表明高溫使飼料中非淀粉類多糖的溶解度增加。對日糧不論是制粒還是擠壓膨化，補充酶混合物都改善了雛雞的生產(chǎn)性能，這表明日糧經(jīng)過擠壓膨化的加工處理后仍然存在酶活。Vukic-Vranjes等（1994）的研究還表明，在日糧中補充酶混合物降低了飼料浸提物的粘度，這說明飼料在雛雞采食前存在酶活。他們甚至在處理飼料之前仍不能排除飼料中酶活的存在。

　　Inborr和Bedford（1994）對補充酶并經(jīng)熱處理的飼料中的酶活及飼喂該飼料的肉雞生產(chǎn)性能進行了測定。結果發(fā)現(xiàn)，在大麥基礎日糧中添加的β-葡聚糖酶（該酶與1993年McCracken等所使用的酶是同一產(chǎn)品）在日糧經(jīng)75攝氏度下調(diào)質及制粒后發(fā)生明顯失活。在95攝氏度下調(diào)質30秒和15分鐘分別使β-葡聚糖酶活性喪失84%和91%。Inborr和Bedford（1994）試圖確定體內(nèi)外酶活的測定是否是評價加工處理對酶活影響的最準確的方法。結果表明，酶活的回收率在最低加工溫度下最高，而在最高加工溫下最低，但該結果并不能通過肉雞的生產(chǎn)性能準確得到體現(xiàn)。肉雞體增重的最高值和耗料增重比的最低值是在居中的調(diào)溫度（85攝氏度）下獲得的。顯然，酶在該溫度下仍然保持活性，并且熱處理的正效應超過酶失活的負效應。

　　 Pickford（1992）研究表明，β-葡聚糖酶的穩(wěn)定化處理可使其免受75攝氏度制粒溫的影響，但不能承受95攝氏度的制粒溫度。Cowan和Rasmussen（1993）報道，商品β-葡聚糖酶在65攝氏度以上制粒溫度下明顯失活，但若對該產(chǎn)品進行涂抹處理，則可使其免受75攝氏度制粒溫的影響。以上兩個報道都很簡短，有關提高β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究報道非常有限。

　　木聚糖酶

　　木聚糖酶在世界酶銷售量中占有最大的份額（Bedford和Schulze，1998），它的應用使得高粘度的小麥可作為飼料原料添加到家禽日糧中，并且不會產(chǎn)生不利的效應?；蛟S由于其經(jīng)濟上的重要性，科技文獻中有關木聚糖酶穩(wěn)定性的報道要比有關β-葡聚糖酶穩(wěn)定性的報道多得多。

　　木聚糖酶可由多種真菌和細菌生產(chǎn)，其酶活的最適條件各不相同，這并不令人驚奇，因為每種生物體內(nèi)都有特定的適應環(huán)境。Bedford和Schulze（1998）的綜述表明，許多真菌和細菌生產(chǎn)的木聚糖酶的最適溫度為30~105攝氏度，最適pH值為2.0~10。Pickford（1992）在未提供酶所含酶活類型資料的情況下比較了3種商品酶制劑的穩(wěn)定性。結果表明，在80攝氏度的制粒溫度下，第一種酶制劑的活性保留85%，第二種酶制劑的活性保留55%，第三種酶制劑的活性僅保留33%。而在95攝氏度的制粒溫度下，這3種酶制劑的活性都全部喪失。在短時高溫下擠壓膨化也使這3種酶制劑的活性發(fā)生較大的損失，其酶活損失的差異與上述相似。

　　Pettersson和Rasmussen（1997）研究證實，由高溫霉（Thermomyces）、腐質霉（Humicola）和木霉（Trichoderma）分離到的木聚糖酶在熱穩(wěn)定性上存在差異。由木霉（Trichoderma）分離到的木聚糖酶在75攝氏度調(diào)質溫度下明顯失活；而由高溫霉與腐質霉分離到的木聚糖酶在85攝氏度調(diào)質溫度下可保留80%以上的活性。其中由高溫霉分離到的木聚糖酶，即使在95攝氏度的調(diào)質溫度下仍可保留70%以上的活性。Gibson（1995）觀察了9種木聚糖酶制劑之間的變異，其中7種在試驗開始時為商品酶制劑產(chǎn)品。結果表明，經(jīng)90攝氏度加工處理后，其中一種酶制劑保留90%以上的酶活，另外7種保留的酶活均低于10%。該報道還不足以說明其變異有多少是由于酶的來源，有多少是由于酶的穩(wěn)定化處理。Perez-Vendrell等（1999a）測定了8種商品酶制劑（包括涂抹或包被產(chǎn)品）在65~70攝氏度、75~80攝氏度和85~90攝氏度調(diào)質處理后的體外穩(wěn)定性。結果表明，即使在最低的調(diào)質溫度下，大多數(shù)產(chǎn)品的酶活仍然至少喪失30%；而在最高調(diào)質溫度下，其酶活可喪失90%。Esteve-Garcia等（1997）報道，正如對β-葡聚糖酶研究所發(fā)現(xiàn)的那樣，細微顆粒型木聚糖酶制劑的酶活在接近80攝氏度的調(diào)質與制粒溫度下也不失活。

　　在前面已提及幾種免受熱處理破壞的保護方法。最基本的酶活保護方法就是Pettersson和Rasmussen（1997）在其研究中所建議的方法，即從耐熱性的微生物體內(nèi)中分離生產(chǎn)耐熱性的酶類。另一種酶活保護方法就是在制粒冷卻后在其飼料顆粒上噴涂酶制劑，但這需要額外增加某些加工設備及加工工序（Perez-Vendrell等，1999b）。

　　對干燥酶制劑產(chǎn)品也可進行穩(wěn)定化處理，從而提高其熱穩(wěn)定性，并可在制粒前將其添加到飼料中而不使其酶活發(fā)生明顯的損失。穩(wěn)定化的方法就是前面所提到的方法。酶的失活是由于調(diào)質所用的蒸汽造成的。因此，對酶制劑進行穩(wěn)定化處理主要是通過將酶制劑吸附到一種載體上或在酶制劑上涂抹疏水性基質，而使酶制劑免受蒸汽的破壞（Cowan，1996）。Pickford（1992）提供了一個例證，其穩(wěn)定化處理使酶制劑經(jīng)75攝氏度制粒后保留的酶活從48%提高到76%，使經(jīng)95攝氏度制粒后保留的酶活從12%提高到34%。顯然，即使進行穩(wěn)定化保護的酶也有熱穩(wěn)定的極限。Steen（1999）建議，如果飼料要在90攝氏度以上的溫度下加工，即使進行穩(wěn)定化處理的酶類也應在加工后添加到飼料中。

　　體外酶活檢測是確定酶活損失的有價值的手段。檢測結果表明，即使經(jīng)受相對較低的溫度，也會導致酶活發(fā)生明顯的損失。不過，體外檢測僅僅是其中的一種手段。顯然，在飼料的處理與消化條件下，緩沖液中的酶制劑在最適pH值下的活性僅僅提供非常有限的酶活信息。事實上，大多數(shù)研究人員（Vukic-Vranjes等，1994；Pettersson和Rasmussen，1997；Perez-Vendrell等，1999a；等等）已經(jīng)認識到酶與飼料之間互作的重要性，并且測定了配合飼料中的酶活。飼料浸提液粘度的測定（Spring等，1996；Bedford等，1997）為在飼料被家禽采食前評定酶活的效應提供了一種指標。Preston等（1999）研究證實了這種效應的存在。其結果表明，即使在其飼料終產(chǎn)品中完全喪失酶活，補充酶制劑仍可使家禽生產(chǎn)性能明顯改善。

　　為了弄清飼料加工處理對酶作用的影響，必須通過家禽生產(chǎn)性能來測定飼料中酶的添加效應與熱處理效應。酶的失活并不總是通過家禽生產(chǎn)性能的差異直接得到反映（Bedford等，1997；Perez-Vendrell等，1999a；Silversides和Bedford，1999）。Bedford等（1997）發(fā)現(xiàn)，隨著加工溫度從65攝氏度增加到105攝氏度，酶的失活百分率呈線性變化，而肉雞的生產(chǎn)性能（體增重、耗料增重比）是在81~83攝氏度的加工溫度時達到最佳。Silversides和Bedford（1999）也證實了熱處理的這種效應，如圖15-1所示。隨著加工溫度的增加，酶的活性呈線性方式降低（R2=0.97），肉雞的體重則呈二次方曲線變化(R2=0.84）。對耗料增重比的結果作圖亦產(chǎn)生相似的結果（R2=0.98）。最大的體重和最低的耗料增重比是在80~85攝氏度之間的加工溫度下獲得的。之所以產(chǎn)生這樣的結果，有兩種可能性：一種可能是酶幾乎在調(diào)質器中完成它的作用，從而使制粒后的分析值毫無關聯(lián)；另一種可能是所用的分析方法不能有效地測定酶活。

　　由涂抹保護層的高溫霉獲得的酶類數(shù)據(jù)與由未涂抹保護層的木霉或曲霉所獲得的酶類數(shù)據(jù)似乎不屬同一類型，這可能是由于前者不存在酶與飼料基質之間的互作。在這種情況下，酶更易被提取，其回收的酶活與家禽生產(chǎn)性能之間的相關性也得到證實（Cowan和Rasmussen，1993；Pettersson和Rasmussen，1997；Andersen和Dalboge，1999）。這些相互矛盾的結果表明，在酶的特性未知的情況下，并沒有唯一的方法可以根據(jù)飼料樣品的分析值來確定家禽的生產(chǎn)性能。

　　隨體外酶活的下降而提高家禽的生產(chǎn)性能，預示著僅僅依賴酶活測定的危險性，但也許并不像顯示的那樣矛盾。加熱除了影響酶外，還影響其他許多方面（Pickford，1992）。適度加熱可以促進淀粉的凝膠化，加速細胞壁的破碎，提高營養(yǎng)素的利用率，從而改善家禽的生產(chǎn)性能。這也是對飼料進行制粒處理的基本原因之一。較高的加工溫度也會使非淀粉類多糖的溶解度增加，從而增加了家禽腸道內(nèi)容物的粘度，降低了家禽的生產(chǎn)性能，這實際上又增加了對外源性酶的需要。Silversides和Bedford（1999）研究表明，在小麥基礎日糧中未添加外源性木聚糖酶的情況下，肉雞腸道內(nèi)容物的粘度隨加工溫度的增加而顯著增加（圖15-2）。而在日糧中添加木聚糖酶時，即使在較高的加工溫度下，也可使肉雞腸道內(nèi)容物的粘度下降，并且在最高溫度下，其粘度實際降低量最大。在較高的加工溫度下，酶仍可發(fā)揮較大的作用，這可能是由于酶在此時可獲得較多的底物。酶在加工前或加工期間可能具有活性，從而降低了體內(nèi)外的粘度測值。較高的加工溫度使家禽的生產(chǎn)性能下降，這不僅是由于腸道內(nèi)容物粘度的增加以及外源性酶的作用減弱，而且是由于維生素和其他酶類的失活，以及淀粉與蛋白質消化率的下降。隨著耐熱性或穩(wěn)定化處理的酶制劑的商品化，加熱對維生素及其他營養(yǎng)物質的破壞也將可能限制生產(chǎn)上所用的加工溫度。

　　結論與趨勢

　　酶在溶液中的活性在低于60攝氏度的溫度下可能就會降低。酶在混合飼料中多少要受到飼料原料的保護，大多數(shù)在稍低的溫度下可能是很穩(wěn)定的。然而，在高達95攝氏度的加工溫度下，酶活將發(fā)生嚴重的損失。為了降低熱處理的不利效應，已采用或推薦使用幾種方法，包括保護酶免受蒸汽滲入、使用耐熱性酶類或者在加工后添加液態(tài)酶。飼料酶在動物采食飼料前可能具有一些活性，因此體外酶活的總損失可能并不總是意味著收益的總損失。這似乎部分依賴于酶及其分析方法。在一些情況下，體外的分析值就是一種誤導；而在另一些情況下，酶的含量與動物的生產(chǎn)性能具有明顯的相關關系。由于維生素、蛋白質及淀粉對熱處理可能比外源性飼料酶更加敏感，提高加工溫度就會增加對這些營養(yǎng)物質的破壞，所以一般加工溫度不能無限制地提高。進一步開發(fā)耐熱性的酶類及在飼料加工或被動物采食前發(fā)揮酶的作用，可能是飼料工業(yè)通過添加酶類而獲得最大收益的有前景的途徑。