體外酶法研究進(jìn)展

　　摘要：消化能值是評(píng)定飼料能量生物學(xué)效的主要指標(biāo)之一?？陀^(guān)精準(zhǔn)地評(píng)定飼料的消化能值是確定動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量及優(yōu)化飼料配方的主要決策依據(jù)。本文主要介紹了體外酶法的研究進(jìn)展，影響評(píng)定準(zhǔn)確性的因素以及體外酶法評(píng)定飼料消化能中存在的一些難題。

　　關(guān)鍵詞：豬;消化能;體外酶法

　　引言

　　能量是飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的第一要素。代謝能值是評(píng)定飼料能量生物學(xué)效的主要指標(biāo)之一，因此，客觀(guān)精準(zhǔn)地評(píng)定飼料的代謝能值是確定動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量及優(yōu)化飼料配方的主要決策依據(jù)。目前評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法主要有體內(nèi)法、半體內(nèi)法(運(yùn)動(dòng)尼龍袋法)和體外法(酶法)。體內(nèi)法和半體內(nèi)法評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在小腸消化率雖然較為客觀(guān)實(shí)際，但都需要依賴(lài)于試驗(yàn)動(dòng)物，半體內(nèi)法還需要借助于必要的瘺管手術(shù)和試驗(yàn)設(shè)備，試驗(yàn)較麻煩且費(fèi)用昂貴，不適于生產(chǎn)實(shí)際，而酶法是利用一種或多種酶或動(dòng)物小腸液模擬動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境，在體外對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化，以評(píng)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，是一種快速且相對(duì)準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法。

　　酶法最早產(chǎn)生于50年代，最初只是用單一胃蛋白酶法評(píng)定飼料蛋白質(zhì)的消化率，雖然這一方法快速簡(jiǎn)便，但與體內(nèi)法所測(cè)數(shù)據(jù)相差較大(Grand 和Carroll,1958; Campbell,1961)。Akeson和Stahmann(1964)進(jìn)一步發(fā)展了酶法，在胃蛋白酶的基礎(chǔ)上又加入了胰蛋白酶，測(cè)得真蛋白消化率與體內(nèi)法所測(cè)數(shù)據(jù)強(qiáng)烈相關(guān)(r=0.995)，使得胃蛋白酶加胰蛋白酶法成為評(píng)定單胃動(dòng)物飼料蛋白質(zhì)消化率的常規(guī)方法, 但這種方法是在假定蛋白消化率不受其他養(yǎng)分消化影響的基礎(chǔ)上建立的，而消化道酶譜是一個(gè)復(fù)雜多變的多酶系統(tǒng)，由于各種酶元所需要的激活條件不同以及酶作用于底物的反饋抑制作用。所以胃蛋白酶加胰蛋白酶法并不能真正反映體內(nèi)消化過(guò)程。日本Furuya(1974)提出了胃蛋白酶加小腸液測(cè)定離體消化試驗(yàn)方法，通過(guò)離體法和全收糞二者比較,兩法干物質(zhì)和能量消化率間均為強(qiáng)相關(guān)，且測(cè)值相當(dāng)一致。國(guó)內(nèi)張子儀等(1981-1988)對(duì)此法做了進(jìn)一步研究，已形成一套完整的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定豬飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的體外方法。

　　國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析

　　自Kuhn (1894)首創(chuàng)用能量直接衡量飼料營(yíng)養(yǎng)以來(lái)，飼料有效能值的評(píng)定已經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)。豬消化能值的研究也是伴隨著研究方法的改進(jìn)而不斷發(fā)展，飼養(yǎng)試驗(yàn)和代謝試驗(yàn)等生物學(xué)法是評(píng)定飼料有效能值較為科學(xué)、合理的一種試驗(yàn)方法，但這些方法往往耗時(shí)、費(fèi)力，很難在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的飼料樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)、分析且不宜標(biāo)準(zhǔn)化。因此，有必要尋求一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的評(píng)定方法。長(zhǎng)期以來(lái)，各國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家試圖通過(guò)酶水解法建立一種快速測(cè)定飼料能量生物學(xué)效價(jià)的方法，但這種方法一直處于實(shí)驗(yàn)室階段而未應(yīng)用于生產(chǎn)，其主要原因就在于未解決方法的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，實(shí)質(zhì)上是消化酶的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，即酶的活性和種類(lèi)。眾所周知，飼料主要在豬的小腸中消化，而豬的胰腺及腸道內(nèi)的消化酶活性并非怛定的，若以胰腺或小腸液作為酶法的消化酶來(lái)源，則因消化酶活性的變異較大而無(wú)法解決標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，因此，根據(jù)豬小腸的酶解特性來(lái)建立與之等效的模擬腸液及仿生消化方法將為豬飼料代謝能值的酶法定量測(cè)定技術(shù)解決重大技術(shù)難題，對(duì)提高我國(guó)豬的生產(chǎn)水平，節(jié)約飼料資源以及減少排泄物對(duì)環(huán)境的污染有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

　　1酶法評(píng)定方法

　　隨著20世紀(jì)30年代胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶結(jié)晶的析出及隨后的各種消化酶測(cè)定方法的發(fā)展，許多學(xué)者將離體消化的模擬模型定格到了由一種或兒種關(guān)鍵酶分步降解的離體反應(yīng)模型，并進(jìn)行了一系列研究，提出了一步酶解法與多步酶解法(張鐵鷹，2002)。

　　1.1一步酶解法

　　一步酶解法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下肽鍵斷裂，由蛋白質(zhì)的水解程度來(lái)判斷蛋白質(zhì)品質(zhì)及其在體內(nèi)的消化率(Sheffner等1956; Taverner和Farrell， 1981; Hewitt等1985; Meer等1990)或由解離出的氫離子導(dǎo)致溶液pH值降低的幅度和蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率之間建立回歸方程，預(yù)測(cè)體內(nèi)蛋白質(zhì)的消化率( Maga等, 1973; Hsu等, 1977 )，但預(yù)測(cè)的精確度可能會(huì)受到多種因素的影響，特別是飼料樣品中礦物質(zhì)緩沖能力的影響。為此，Pedersen和Eggum等(1983)對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，即用NaOH不斷中和蛋白質(zhì)水解過(guò)程產(chǎn)生的氫離子，使PH值保持不變。此方法雖然簡(jiǎn)單、快速，但考慮的因素較單一。由于抗?fàn)I養(yǎng)因子、熱處理及飼料物理性狀的影響，測(cè)定結(jié)果與生物學(xué)法的相關(guān)性很低，且僅限于對(duì)飼料蛋白質(zhì)消化率進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)，不適合對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行評(píng)定。

　　1.2多步酶解法

　　飼料養(yǎng)分在動(dòng)物體內(nèi)的消化過(guò)程是由物理消化與多種消化酶共同參與下完成的，只有充分考慮養(yǎng)分在體內(nèi)消化的各種關(guān)鍵因素，不斷改進(jìn)對(duì)消化道內(nèi)各種環(huán)境條件的模擬，才能使預(yù)測(cè)結(jié)果更科學(xué)。隨著畜禽消化生理學(xué)及酶學(xué)的發(fā)展，單胃動(dòng)物體外消化模擬技術(shù)也得到了發(fā)展，已由過(guò)去的單一酶法發(fā)展為現(xiàn)在的多酶法。多酶法不但對(duì)胃消化過(guò)程進(jìn)行模擬，而且還對(duì)胰腺分泌消化酶、小腸消化以及大腸微生物消化等過(guò)程進(jìn)行模擬，即由兒種消化酶同時(shí)完成畜禽體內(nèi)消化過(guò)程。根據(jù)后段消化道模擬部位的不同，多酶法可簡(jiǎn)單分為胃-小腸兩步法和胃-小腸-大腸三步法。

　　1.2.1胃-小腸兩步法

　　Buchmann等(1979)使用胃蛋白酶一胰酶來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的體內(nèi)消化率，利用該方法所測(cè)定30種大麥蛋白體外消化率與大鼠體內(nèi)消化率存在很強(qiáng)的相關(guān)性。其后，Boisen等(1991) , Boisen和Fernandez等(1995)主要針對(duì)此方法中降解物與未降解物的分離方法進(jìn)行了研究并提出了修改方案。修訂后的方案所測(cè)飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、蛋白質(zhì)、能量的消化率與生物學(xué)法均存在強(qiáng)相關(guān)關(guān)系。但此方法中，消化產(chǎn)物不斷積累會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致體外養(yǎng)分消化率降低，影響其預(yù)測(cè)體內(nèi)養(yǎng)分消化率的準(zhǔn)確性。此外，此方法中用三氯乙酸或磺基水楊酸溶液來(lái)沉淀反應(yīng)液中未被降解但溶于水的蛋白質(zhì)，然而淀粉和脂肪的消化產(chǎn)物并不能簡(jiǎn)單地以三氯乙酸或磺基水楊酸來(lái)分離。同時(shí)，一些可以被動(dòng)物吸收的小肽也被人為的劃分為未被消化蛋白。為此，一些學(xué)者為了克服消化產(chǎn)物累積對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用，建立了以透析為手段去除消化產(chǎn)物的方法并對(duì)消化酶的濃度、飼料粒度、透析時(shí)間、透析袋截留分子量大小、透析液流速及酶促反應(yīng)溫度等因素進(jìn)行了一些研究，得出透析法與生物學(xué)法的相關(guān)性比未去除產(chǎn)物法更高的結(jié)論，并提出了幾套體外消化模擬操作規(guī)程(Cave等> 1988;Gauthier等，1982; Savoie和Gauthier, 1986; Drake,1991;黃瑞林等，1999;張鐵鷹等，2002)。

　　這些方法所采用的透析袋截留分子量為1OOODa, 恰好能夠使氨基酸和部分小肽通過(guò)，這與蛋白質(zhì)在體內(nèi)的實(shí)際吸收情況比較接近。因此，其在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的體內(nèi)消化率上比未去除產(chǎn)物方法更合理。然而透析袋的孔徑主要針對(duì)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，并不能改善對(duì)飼料有效能及其它養(yǎng)分消化率的預(yù)測(cè)值。畜禽采食的飼料經(jīng)過(guò)胃初步消化后，通過(guò)胃運(yùn)動(dòng)分批轉(zhuǎn)運(yùn)到下一段消化道(十二指腸)。因此，如果利用豬小腸液測(cè)定飼料體外消化率，除胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等主要消化酶外，胰臟分泌的微量物質(zhì)、肝臟分泌物及腸肽酶等一些影響?zhàn)B分消化的成分均可通過(guò)豬小腸液來(lái)獲得。這樣可以使體外消化模擬過(guò)程與體內(nèi)更接近，所測(cè)定結(jié)果也更可靠合理。中國(guó)農(nóng)科院畜牧研究所在20世紀(jì)80年代對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和改進(jìn)，建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序，利用該方法測(cè)定的飼料干物質(zhì)和能量體外消化率與生物學(xué)法間存在強(qiáng)相關(guān)(R2=0.95 0.98).

　　1.2.3胃-小腸-大腸三步法

　　一步及兩步酶解法主要模擬了胃或胃與小腸的消化，并沒(méi)有考慮回腸以后微生物的作用，而豬后段消化道微生物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸所提供的能量大約占日糧中提供能量的12%(Kass 等, 1980)。以這些方法來(lái)預(yù)測(cè)養(yǎng)分的表觀(guān)消化率及有效能時(shí)存在一定的局限。Fonty和Goue(1989)及Ahrens等(1991)發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物與豬大腸內(nèi)微生物的組成和發(fā)酵原理存在許多共同之處，為此，一些學(xué)者提出了胃蛋白酶一胰酶一瘤胃液(Fonty和Gouet, 1989)及胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法，并建立了操作規(guī)程(Metz和VanderMeer, 1985; Boisen和Fernandez, 1994,1997)。瘤胃液法與碳水化合物酶法相比消化處理所用時(shí)間長(zhǎng)，受瘤胃液的來(lái)源影響較大;而碳水化合物酶是一種商品，組分穩(wěn)定，而且消化處理所用時(shí)間也較短。Boisen和Fernandez(1997)利用碳水化合物酶法測(cè)定的90個(gè)飼料樣品和31種配合飼料的體外有機(jī)物質(zhì)消化率與體內(nèi)能量消化率之間存在線(xiàn)性相關(guān)(RZ=0.94)，這表明利用胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法能夠較好地預(yù)測(cè)單胃動(dòng)物飼料的消化能。

　　2影響酶法評(píng)定效果的因素

　　2.1動(dòng)物品種及小腸部位的影響

　　陳雪秀等(1984)研究了用不同品種豬(杜北、長(zhǎng)楓、北京黑)小腸液測(cè)得離體消化率

　　的比較，結(jié)果表明，北京黑豬的小腸液的淀粉酶和胰蛋白酶活均高于杜北，用杜北豬小腸液測(cè)出的離體干物質(zhì)消化率及能量消化率在測(cè)定低蛋白日糧時(shí)與長(zhǎng)楓、北京黑豬無(wú)差異，應(yīng)用杜北豬小腸液測(cè)定高蛋白日糧時(shí)其離體能量消化率比北京黑豬小腸液的測(cè)值低(P<0.05)。

　　研究表明小腸液的酶活與小腸的部位有關(guān)，(Toofanian等，1973;iddons,1968;Russell等，1981)，因而從小腸不同部位采集的小腸液酶活不同，所測(cè)得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)離體消化率可能不同。Keys等(1974)報(bào)道，飼料中的養(yǎng)分在小腸各部位的消化率有很大差異，在小腸上部的有機(jī)表觀(guān)消化率為29.8%，而在小腸中下部達(dá)65.9%。陳雪秀等(1984)研究表明，用距幽門(mén)50cm處采集的豬前瘺小腸液處理的離體消化率與常法相差較大，如干物質(zhì)消化率比常法低4.7%-5.1%，能量消化率低6.5-8%，而用距幽門(mén)170cm處采集的后瘺小腸液的測(cè)值與常法相近。

　　2.2不同日糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)小腸液的影響

　　動(dòng)物日糧水平影響小腸消化酶的活性(Clary等，1969;Van Hellen等1978; Russell等1981;Jahnson等1977; Owens等，1986)。因而用來(lái)源于不同日糧類(lèi)型的小腸液測(cè)得的離體消化率可能存在差異。Karrel等(1966)和Owens等(1986)報(bào)道，淀粉酶的活性是影響淀粉在小腸消化率的因素之一。王述容等(1981)報(bào)道，在采集豬小腸液前連續(xù)十天喂給單一飼料-麩皮，然后采集腸液，用此腸液與混合料腸液處理的離體消化率比較，混合料處理的離體干物質(zhì)消化率比單喂麩皮處理的高7-10%，但蛋白和能量的消化率相差不大。而姜云俠等(1983)研究表明，飼喂不同營(yíng)養(yǎng)水平日糧(高能量低蛋白日糧和低能量高蛋白日糧)的豬小腸液對(duì)離體干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率無(wú)顯著影響。

　　2.3環(huán)境PH及Ca2+的影響

　　梁皓儀等(1988)報(bào)道，豬小腸液凍干粉(PIF )對(duì)粗蛋白質(zhì)的消化率受pH的影響較小，當(dāng)pH在7.0-8.5范圍內(nèi)，PIF對(duì)蛋白質(zhì)的消化率無(wú)大的差異。

　　2.4小腸液凍干粉的用量與離體消化率的關(guān)系

　　張建中(1997)研究了牛小腸液凍干粉(BIF)的用量對(duì)淀粉消化率的影響，研究表明，當(dāng)BIF用量為0.3克時(shí)//0.5克飼料(BIF中淀粉酶的活性為302.18IU/g)，淀粉的消化率趨于穩(wěn)定，再增加BIF用量，其淀粉消化率變化不大。李建國(guó)(1997)就BIF用量對(duì)瘤胃非降解蛋白(UDP)消化率的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果當(dāng)小腸液凍干粉用量在12單位//0.5克UDP以上時(shí)，UDP的消化率基本穩(wěn)定，因此，在用小腸液凍干粉測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠迷氯椤?/p>

　　2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)離體消化率的影響

　　梁皓儀等(1988)分別測(cè)定了三種豬日糧經(jīng)胃蛋白酶一PIF消化3小時(shí)和4小時(shí)后的粗蛋白消化率，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)樣品粗蛋白的消化率沒(méi)有影響。王忠生(1994)用胃蛋白酶和BIF結(jié)合評(píng)定UDP消化率的試驗(yàn)結(jié)果為，當(dāng)把胃蛋白酶的處理時(shí)間固定在4小時(shí)，延長(zhǎng)BIF的培養(yǎng)時(shí)間，飼料UDP消化率有增長(zhǎng)趨式，但培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)6小時(shí)，增長(zhǎng)出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。張建中(1997)就BIF對(duì)淀粉、熟淀粉及瘤胃24小時(shí)玉米殘?jiān)碾x體消化試驗(yàn)表明，對(duì)于淀粉和熟淀粉，BIF的培養(yǎng)時(shí)間從6小時(shí)開(kāi)始穩(wěn)定，6小時(shí)后各時(shí)間點(diǎn)的消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)，玉米和瘤胃24小時(shí)玉米殘?jiān)牡矸巯蕪?小時(shí)后穩(wěn)定，7小時(shí)后各時(shí)間點(diǎn)的淀粉消化率差異不顯著(P>0.05)，通過(guò)以上研究結(jié)果可看出，用小腸液凍干粉做離體消化試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的飼料選擇不同的培養(yǎng)時(shí)間。

　　2.6小腸液凍干粉不同加工條件及不同保存條件對(duì)離體消化率的影響

　　張蔚云等(1984-1985)對(duì)不同加工工藝及不同保存條件下的PIF的胰蛋白酶活，離體干物質(zhì)消化率，離體能量消化率進(jìn)行了效價(jià)檢驗(yàn)，結(jié)果表明，不同加工和保存條件下(小腸液一次解凍與二次解凍;凍干后的PIF抽真空保存與不抽真空保存：抽真空保存的PIF分別貯存于室溫和0℃冰箱中)，PIF的胰蛋白酶活性基本上無(wú)顯著變化((P>0.05);在加工前的PIF原料不論是二次解凍還是一次解凍，貯存時(shí)無(wú)論抽真空還是不抽真空，只要保存在25℃以下，至少可保持3個(gè)月效價(jià)穩(wěn)定不變。但當(dāng)溫度超過(guò)25℃時(shí)，PIF凍干粉效價(jià)有下降趨勢(shì)。

　　3，目前存在的難題

　　離體評(píng)定方法從操作的簡(jiǎn)便性和模擬結(jié)果的科學(xué)合理性方面均有很大發(fā)展，但仍然存在許多不足之處。首先，消化模型中各項(xiàng)消化參數(shù)只是部分與體內(nèi)實(shí)際情況相吻合，而有些參數(shù)則相差較遠(yuǎn)，需要繼續(xù)完善和發(fā)展。其次，多數(shù)消化模型沒(méi)有考慮到日齡對(duì)動(dòng)物體內(nèi)能量消化率的影響，不能對(duì)飼料能量在不同生長(zhǎng)階段的畜禽體內(nèi)的消化率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，尤其是仔豬等生長(zhǎng)速度較快的動(dòng)物。由此可見(jiàn)，用離體法預(yù)測(cè)飼料有效能值方法的研究仍任重道遠(yuǎn)。